Nació en Oviedo en 1893, en el seno de una familia conservadora de tradición militar y eclesiástica. Su padre era gallego y su madre vasca. Fue educado en seminarios donde aprendió latín y posteriormente en la Universidad Pontificia de Comillas, bajo la influencia de sus tíos Victoriano Guisasola Rodríguez (1820–1888) y Victoriano Guisasola y Menéndez (1852–1920).
En 1913 fue pensionado por la Junta de Ampliación de Estudios del Centro de Estudios Históricos, entrando en la recién creada Escuela Filológica bajo la tutela de Menéndez Pidal.
En 1914 impartió cursos de Latín en la Residencia de Estudiantes, donde asimiló los métodos de la Institución Libre de Enseñanza. En 1916 se licenció en Letras por la Universidad Central de Madrid y en 1920 obtuvo la cátedra de Lengua Latina en el Instituto de Almería, ciudad en la que residió el resto de su vida.
Su obra más relevante fue Observaciones sobre las fuentes literarias de La Celestina (1924), donde analizó minuciosamente las influencias literarias de la tragicomedia y estableció la teoría de la doble autoría. La crítica española acogió favorablemente el estudio, aunque fueron los hispanistas ingleses —Peter Russell, Alan Deyermond y Dorothy Severin— quienes difundieron y consolidaron su importancia como primer estudio moderno sobre La Celestina.
Además del tema celestinesco, sus investigaciones abarcaron cuatro grandes áreas:
La Guerra Civil agravó su enfermedad y falleció en Almería el 8 de diciembre de 1945, en plena madurez investigadora. Su legado fue difundido principalmente por los hispanistas ingleses, que lo reconocieron como referente en los estudios celestinescos.
Su trayectoria refleja:
Florentino Castro Guisasola fue un filólogo y profesor cuya obra sobre La Celestina marcó un hito en los estudios literarios. Su labor docente en Almería y sus investigaciones en literatura, historia y folclore lo convierten en una figura esencial de la filología española del siglo XX.