Antonio de Berrío y Oruña nació en Berja en 1527, en el seno de una familia hidalga. Se trasladó joven a América, donde participó en campañas militares en el Nuevo Reino de Granada.
En 1584 heredó de su suegro, el adelantado Gonzalo Jiménez de Quesada, los derechos sobre la gobernación de Guayana, lo que lo impulsó a organizar expediciones en busca del mítico Reino de El Dorado.
Entre 1584 y 1591 dirigió varias exploraciones por la cuenca del Orinoco y el interior de Venezuela, enfrentándose a enormes dificultades geográficas y a la resistencia indígena. Su empeño lo convirtió en uno de los principales protagonistas de la leyenda de El Dorado.
En 1595 se encontró con el corsario inglés Sir Walter Raleigh, quien lo capturó en Trinidad y lo llevó a Inglaterra. Aunque liberado posteriormente, este episodio marcó la rivalidad anglo-española en el Caribe.
Antonio de Berrío falleció en Bogotá en 1597, dejando a su hijo Fernando de Berrío la misión de continuar la búsqueda de El Dorado.